Практическая работа № 2
^ Приготовление питательных сред.
Цель. Приготовление питательной среды для культивирования клеток и тканей in vitro.
Объяснение. Компоненты среды для выращивания растительных клеток и тканей можно разделить на 6 основных групп, что обычно отражает порядок приготовления концентрированных маточных растворов: макроэлементы, микроэлементы, источники железа, витамины, источники углерода, фитогормоны.
Основой для всех питательных сред для культивирования растительных эксплантов является смесь минеральных солей. Это соединения азота в виде нитратов, нитритов, солей аммония; фосфора – в виде фосфатов; серы – в виде сульфатов; а также растворимых солей К+, Na+, Са++, Мg++. Железо используется в виде хелатов [FeО4 или Fe2O4 + ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или её натриевая соль Na ЭДТА (трилон Б)] – наиболее доступной форме для усвоения растительными тканями.
Азот, фосфор, сера входят в состав органических соединений: белков, жиров, нуклеиновых кислот. Железо, цинк, марганец, молибден, кобальт в сочетании с порфиринами образуют макромолекулы пигментов фотосинтеза (хлорофилла), окислительно-восстановительных ферментов (каталазы, пероксидазы, полифенолоксидазы). Следовательно, все эти соединения выполняют в клетках и тканях структурную функцию. В то же время ионы К+, Na+, Са++, Cl –, Н + необходимы для регуляции pH среды и поддержания физиологических градиентов клеток (тургора, осмотического давления, полярности).
В качестве источника углерода для биологических макромолекул, а также при культивировании гетеротрофных тканей (каллусов и суспензий) в питательные среды добавляют углеводы в концентрации 20-60 г/л. Обычно это дисахариды (сахароза), моносахариды (гексозы: глюкоза и фруктоза, пентозы: ксилоза и другие). Полисахариды в питательных средах практически не используются. Только некоторые типы тканей (опухолевые), содержащие гидролитические ферменты, выращивают на средах с крахмалом, рафинозой, целлобиозой.
Для стимуляции биохимических реакций в клетке используют биологические катализаторы – витамины группы В (В1, В6, В12), С (аскорбиновую кислоту), РР (никотиновую кислоту), мезоинозит.
Тиамин (В1) входит в состав пируватдекарбоксилазы, участвует в превращениях углеводов. Тиаминпирофосфат входит в состав ферментов окислительного декарбоксилирования кетокислот (пировиноградной и кетоглутаровой), является коферментом транскетолазы.
Пиридоксин (В6) в виде фосфорнркислого эфира входит в состав ферментов декарбоксилирования и переаминирования аминокислот.
Никотиновая кислота (РР) в виде амида входит в состав дегидрогеназ НАД и НАДФ, катализирующих донорно-акцепторную цепь Н+ (отнятие Н+ от молекул органических веществ).
Для управления процессами формообразования в культуре тканей необходимы биологические регуляторы роста и развития – фитогормоны. Эти вещества влияют на дифференциацию и дедифференциацию клеток и тканей, инициируют гистогенез, индуцируют деление и растяжение клеток, участвуют в процессах старения и созревания, либо стимулируют, либо ингибируют рост и развитие клеточных культур, обуславливают формирование пола. В биотехнологических исследованиях чаще используют гормоны, стимулирующие рост и развитие: ауксины, цитокинины, гиббереллины.
Ауксины: ИУК – -индолил-3-уксусная кислота, ИМК – индолил-3-мас-ляная кислота, НУК – -нафтилуксусная кислота, 2,4-Д – 2,4-дихлорфенокси-уксусная кислота.
Цитокинины: кинетин – 6-фурфуриламинопурин, зеатин, NN-дифенил-мочевина, 6-БАП – 6-бензиламинопурин.
Гиббереллины: гиберрелловая кислота.
В качестве биологических добавок для индукции первичного каллуса можно использовать растительные экстракты (10-15 % от общего объёма среды): кокосовое молоко (жидкий эндосперм кокосового ореха), вытяжки из незрелых зерновок кукурузы (лучше в период молочной спелости), которые содержат цитокинины – кинетин и зеатин (6-ти замещенные аминопурины) и NN-дифенилмочевину.
В культуре in vitro применяют жидкие и агаризованные (твердые) среды. Жидкие среды используются для культивирования суспензий, каллусов, изолированных органов и тканей, растений-регенерантов. При этом для поддержания эксплантов в пробирки со средой помещают специальные мостики-поддержки из фильтровальной бумаги или синтетических пористых материалов.
Агаризованные среды готовят на основе агар-агара – полисахарида, входящего в состав морских водорослей, который образует с водой гель при pH 5,6-6,0. иногда в качестве уплотнителя и заменителя агар-агара используют полиакриламидные гели (биогели) P10 и P200.
Для искусственных питательных сред растворы макро- и микросолей готовят заранее и используют многократно. Это маточные (концентрированные) растворы. Их хранят в специальных условиях: макро- и микросоли в холодильнике в сосудах с притертыми пробками при 0…+4оС; витамины, фитогормоны, ферменты, растительные экстракты – при -20оС в небольших по 5-10 мл сосудах с пробками (пеницилловые флаконы).
Маточные растворы макросолей обычно превосходят рабочие по концентрации в 10-40 раз, микросолей – в 100-1000 раз, витаминов – в 1000 раз.
Растворы фитогормонов желательно готовить непосредственно перед работой со средами.
Для приготовления маточного раствора макро- и микросолей каждую соль растворяют в отдельном стаканчике при нагревании, затем сливают и доводят до нужного объема. В охлажденную смесь микросолей последним добавляют раствор солей молибдена, а в макросоли – раствор солей магния (для предотвращения выпадения осадка).
Маточные растворы хлористого кальция и хелата железа (сернокислое железо + ЭДТА, либо Na ЭДТА – трилон Б) готовят и хранят отдельно от других солей.
Концентрированные растворы витаминов готовят следующим образом: 10-кратные навески растворяют в 10 мл дистиллированной воды каждый отдельно.
Фитогормоны – это вещества, которые плохо растворяются в воде. Поэтому предварительно 100 мг вещества растворяют в небольших количествах (0,5-2,0 мл) спирта (ауксины, гиббереллины), 0,5-1 н HCl или КОН (цитокинины), затем подогревают до полного растворения (кроме абсцизовой кислоты и кинетина) и доводят до 100 мл объема (1 мл содержит 1 мг вещества).
^ Материалы и оборудование. Химические стаканы, колбы, мерные цилиндры от 5 мл до 2 л, пробирки, пипетки от 0,01 мл до 10 мл или дозаторы, весы аналитические до 500 г, весы торсионные до 100 мг, пинцеты, ножницы, шпатели, электроплитки, магнитные мешалки, химические реактивы или готовые маточные растворы макро- и микросолей, витаминов, фитогормонов.
^ Ход работы.
В химический стакан емкостью 2 л поместить 20 г сахарозы, долить дистиллированной водой до 400 мл и растворить.
Добавить к раствору сахарозы 50 мл маточного раствора макросолей, 1 мл микросолей, 5 мл хелата железа, 5 мл хлористого кальция.
Приготовить агар: навеску 7 г поместить в стакан и залить водой до 200 мл, растворить, нагревая плитке или газовой горелке, при постоянном помешивании. Готовый агар долить к раствору солей.
Питательную среду довести до нужного объема (1 л) дистиллированной водой. Измерить pH среды: если pH превышает 5,5-6,0 добавить несколько капель 0,1 н HCl, если ниже этого значения – 0,1 н КОН.
Готовую питательную среду разлить в пробирки на 1/3 объема, закрыть пробирки ватными пробками, поместить пробирки в металлические штативы.
Штативы с пробирками завернуть в целлофановую бумагу (чтобы в автоклаве не открылись пробки).
Поместить штативы с пробирками в автоклав и проавтоклавировать.
Контрольные вопросы:
Каковы компоненты включают среды для выращивания растительных клеток и тканей.
На основе каких веществ готовят агаризованные среды.
Какова методика приготовления маточных растворов микро- и макросолей.
Какие существуют типы питательных сред.
Опишите методику приготовления жидкой питательной среды.
Задание для СРСП:
Применение фитогормонов в питательных средах для культивирования клеток и тканей.
Искусственные питательные среды.
Задание для СРС:
оформить результаты практической работы № 2. Ответить на вопросы для самопроверки. Подготовиться к опросу. Составить словарь определений по темам лекции и СРСП.
^ Практическая работа № 3
Выделение протопластов из мезофилла листаЦель: получение жизнеспособных протопластов из мезофилла листа табака и картофеля.
^ Материалы и оборудование. Асептические растения. Стерильные среды (табл.1), ферменты. Чашки Петри диаметром 10 см, колбы на 50 мл, пастеровские пипетки, колбочки со стеклянными воронками и нейлоновыми фильтрами с диаметром пор 60 мкм, мерные пипетки на 1 и 10 мл, центрифужные пробирки на 10 мл, шприц с насадкой для фильтров и фильтры с диаметром пор 0,22 мкм, пинцеты, скальпели, настольная центрифуга, инвертированный микроскоп.
Протопласт — клетка, лишенная клеточной стенки с помощью ферментативного разрушения или механическим способом. Массовое получение «голых» клеток стало возможным благодаря Э. Кокингу, который в начале 60-х годов разработал способ разрушения клеточной оболочки, не повреждающий живое содержимое клетки, и изолировал отдельные протопласты высших растений. Он обрабатывал кончики корней томата гидролитическим ферментом из культуральной жидкости плесневых грибов и впервые получил изолированные протопласты энзиматическим путем.
Для обозначения процесса гибридизации с помощью слияния протопластов используются несколько терминов-синонимов: парасексуальная гибридизация, соматическая гибридизация, неполовая гибридизация. Однако значительно чаще используется термин «соматическая гибридизация», т. е. гибридизация в обход полового скрещивания, когда в качестве родительских клеток используются протопласты - соматические клетки, лишенные клеточной стенки. Растения-регенераты, возникающие in vitro из гибридных клеток, называются соматическими гибридами.
Протопласт является идеальным реципиентом для чужеродной ДНК, которая часто представляет собой плазмиды. Такая трансформация, обеспечивая проникновение и последующую экспрессию этой ДНК, может приводить к образованию генетически модифицированных растений. Таким образом, выделение, культивирование, слияние протопластов и перенос в них клеточных органелл, отдельных хромосом, ДНК позволит генетикам и селекционерам расширить разнообразие получаемых гибридных растений (рис. 36).
Успешное выделение протопластов зависит от многих факторов: типа ткани (лист, семядоля, корень, пыльцевые зерна, каллусная ткань, клеточная суспензия), вида растения и сорта, физиологического состояния растения, состава ферментов, их качества, рН среды и вида осмотика.
В нативной клетке протопласт прижат к клеточной стенке давлением, создаваемым центральной вакуолью, или тургорным давлением. Через клеточную стенку проходят протоплазматические тяжи - плазмодесмы, соединяющие цитоплазму данной клетки с цитоплазмой всех соседних клеток. Клеточная стенка с протопластом составляет единый структурно-функциональный комплекс. Чтобы не повредить содержимое клетки при растворении клеточной стенки, клетку подвергают плазмолизу. В качестве осмотика используются сахароза, маннит, сорбит. Под действием гипертонических растворов этих веществ клетка обезвоживается, протопласт сжимается и отстает от целлюлозно-пектиновой оболочки. Кроме того, высокое осмотическое давление среды выделения протопластов предохраняет их от осмотического шока, поскольку протопласты осмотически нестабильны (рис. 37). Иногда, если клетка вытянутая, протопласт при плазмолизе разбивается на части. В этом случае часть, в которую не попало ядро, называется цитопластом, это безъядерный субпротопласт.
^ Ход работы. За сутки до опыта готовят ферментный раствор для выделения протопластов из мезофилла листа. Ферментная смесь содержит 0,5%-ную целлюлозу, 0,5%-ную мацеразу, 0,2%-ную дреселлазу, которую растворяют в растворе сахарозы (0,5 моль/л) и CaCl2 (50 ммоль/л), рН 5,5-5,6. Приготовленный раствор центрифугируют для осаждения нерастворимых частиц в течение 10-15 мин при 1,5-2 g. После доведения рН до 5,5-5,6 раствор при помощи шприца с насадкой фильтруют через фильтр в чашки Петри по 7-10 мл в каждую.
Молодые листья табака от растений, выращенных в асептических условиях, переносят в стерильные чашки Петри и нарезают узкими полосками или елочкой. Затем листья сразу помещают на поверхность ферментного раствора. Чашки переносят в термостат при 28-300С на 15-18 ч. Для 1 г ткани достаточно 10 мл ферментного раствора. Контроль за ферментацией осуществляют с использованием инвертированного микроскопа. Аналогичным образом можно провести ферментацию из растений любых видов, но при этом следует изменить состав раствора. Так, для выделения протопластов из мезофилла картофеля применяют смесь, состоящую из 1%-ного целлюлазина, 0,5%-ной мацеразы и 0,1%-ной дреселлазы. После ферментации содержимое чашки фильтруют через нейлоновый фильтр в пустую стерильную колбу. Затем пипеткой суспензию, содержащую протопласты, переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 3 мин при 1g. Протопласты всплывают на поверхность. Их отбирают пастеровской пипеткой и переносят в центрифужную пробирку, заполненную до половины средой W-5 (табл.1 приложения). Протопласты центрифугируют в этой среде 2 мин при 700 g, для того чтобы отмыть от остатков ферментной смеси. Отмывку проводят дважды. При центрифугировании в питательной среде W-5 протопласты осаждаются. Это последний этап в процессе их выделения. В некоторых случаях рекомендуют центрифугирование смеси в градиенте сахарозы, тогда протопласты формируют кольцо на поверхности среды. Отбирают их также пастеровской пипеткой. Индукция морфогенеза (стеблей и корней) в каллусе приводит к образованию растений-регенерантов (рис. 38).
^ Получение жизнеспособных протопластовСуществует специальный метод определения жизнеспособности, т. е. метаболической активности протопластов по окрашиваемости их флуоресцеиндиацетатом (ФДА). ФДА - это нефлуоресцирующее соединение, которое легко проходит через плазматическую мембрану протопластов, но только в живых протопластах расщепляется эстеразами. Расщепление приводит к высвобождению флуоресцеина, который задерживается лишь внутри протопластов с интактными мембранами. Метаболически активные (жизнеспособные) протопласты в ультрафиолетовом свете становятся визуально различимыми по зеленому свечению благодаря возбуждению накопленного флуоресцеина.
Качество суспензии протопластов определяется процентом жизнеспособных протопластов. Подсчет протопластов проводят в камере Фукса - Розенталя. Плотность протопластов (количество в 1 мл суспензии) - важная характеристика, определяющая их начальный выход и необходимая для всех последующих манипуляций с ними. Хорошим выходом протопластов считается получение от 1x106 до 5x106 жизнеспособных протопластов из 1 г сырой массы ткани растения или культивируемых клеток.
Отмытые от ферментного раствора жизнеспособные протопласты выходят из состояния шока, в них наблюдается репарация поврежденных структур и начинается подготовка к регенерации стенки. В изотоническом полноценном питательном растворе в асептических условиях протопласты могут существовать в течение многих дней и недель и сохранять способность к делению.
^ Таблица 1. Среды для культивирования протопластов табака